细菌培养操作流程（细菌的培养方法及培养基的配置）

一、目的

学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理

在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。实验室中zui常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一） 实验材料

大肠杆菌

（二） 试剂

1、胰蛋白胨

2、酵母提取物

3、氯化钠

4、1mol/LNaOH

5、琼脂粉

6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）

（三）仪器

1、培养皿

2、带帽试管

3、涂布器

4、灭菌锅

5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）

6、恒温摇床

四、操作步骤

（一）LB培养基的配制

配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：

细菌培养用胰蛋白胨 10g

细菌培养用酵母提取物 5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。加入去离子水至总体积为lL，在15 lbf／in2 (1.034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。

LB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。

（二）细菌的培养

（１）在液体培养基中培养

1、过夜培养

⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。

⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。

⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。

２、大体积培养

⑴按1∶100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。

⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。

（２）在固体培养基中培养 细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。

平板划线法分离单菌落

⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。

⑵重新消毒接种环，从一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。

⑶于37℃培养直至长出单菌落。